Comment faire une analyse spectrophotométrique: 13 étapes (avec des images)

La spectrophotométrie est une technique expérimentale utilisée pour mesurer la concentration de solutés dans une solution spécifique en calculant la quantité de lumière absorbée par ces solutés. Cette technique est puissante car certains composés absorbent différentes longueurs d`onde de lumière à différentes intensités. En analysant la lumière qui traverse la solution, vous pouvez identifier des substances dissoutes particulières en solution et la concentration de ces substances. Un spectrophotomètre est l`appareil utilisé pour analyser des solutions dans un cadre de recherche de laboratoire.

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Partie 1 de 3:

Préparer les échantillons

1. Allumez le spectrophotomètre. La plupart des spectrophotomètres doivent se réchauffer avant qu`ils puissent donner une lecture précise. Allumez la machine et laissez-la reposer pendant au moins 15 minutes avant d`exécuter des échantillons.

Utilisez le temps d`échauffement pour préparer vos échantillons.

Image intitulée DO Spectrophotométrique Étape 2

2. Nettoyez les cuvettes ou les tubes de test. Si vous faites un laboratoire pour l`école, vous pouvez utiliser des tubes à essai jetables qui n`ont pas besoin d`être nettoyés. Si vous utilisez des cuvettes ou des tubes de test réutilisables, assurez-vous qu`ils sont correctement nettoyés avant utilisation. Rincer chaque cuvette à fond avec de l`eau désionisée.

Prenez soin des cuvettes car ils peuvent être assez chers, en particulier s`ils sont fabriqués à partir de verre ou de quartz. Les cuvettes de quartz sont conçues pour une utilisation dans la spectrophotométrie UV-visible.

Lors de la manipulation de la cuvette, évitez de toucher les côtés de la lumière passera (généralement, les côtés clairs du conteneur). Si vous touchez accidentellement ces côtés, essuyez la cuvette avec un kimwipe (qui sont formulés pour éviter de gratter le verre).

Image intitulée DO Analyse spectrophotométrique Étape 3

3. Charger le volume approprié de l`échantillon dans la cuvette. Certaines cuvettes ont un volume maximum de 1 millilitre (ml) tandis que des tubes à essai peuvent avoir un volume maximum de 5 ml. Tant que le laser produisant la lumière passe à travers le liquide et non une partie vide du conteneur, vous obtiendrez une lecture précise.

Si vous utilisez une pipette pour charger vos échantillons, utilisez une nouvelle pointe pour chaque échantillon pour empêcher la contamination croisée.

Image intitulée Do analyse spectrophotométrique STEP 4

4. Préparer une solution de contrôle. Connu sous le nom de blanc, la solution de contrôle n`a que le solvant chimique dans lequel le soluté à analyser est dissous dans. Par exemple, si vous aviez du sel dissous dans de l`eau, votre blanc serait juste de l`eau. Si vous vous colorez le rouge de l`eau, le blanc doit également contenir de l`eau rouge. Le blanc est le même volume que la solution à analyser et conservé dans le même type de conteneur.

Image intitulée Do analyse spectrophotométrique Étape 5

5. Essuyer l`extérieur de la cuvette. Avant de placer la cuvette dans le spectrophotomètre, vous voulez vous assurer qu`il est aussi propre que possible pour éviter les interférences de la saleté ou des particules de poussière. En utilisant un chiffon libéré, éliminez toutes les gouttelettes d`eau ou la poussière qui peut être à l`extérieur de la cuvette.

Partie 2 de 3:

Courir l`expérience

1. Choisissez et définissez la longueur d`onde de la lumière pour analyser l`échantillon avec. Utilisez une seule longueur d`onde de lumière (couleur monochromatique) pour rendre les tests plus efficaces. La couleur de la lumière choisie doit être connue pour être absorbée par l`un des produits chimiques dont la pensée est dans le soluté de test. Définir la longueur d`onde souhaitée en fonction des spécifications de votre spectrophotomètre.

Dans un laboratoire de classe, la longueur d`onde sera probablement donnée à vous.
Étant donné que l`échantillon reflétera toute la lumière de la même couleur qu`elle apparaît, la longueur d`onde expérimentale sera toujours une couleur différente de celle de l`échantillon.

Les objets apparaissent comme certaines couleurs parce qu`ils reflètent la lumière de longueurs d`onde particulières et absorbent toutes les autres couleurs. L`herbe est verte parce que la chlorophylle est reflétant la lumière verte et absorbe tout le reste.

Image intitulée DO Spectrophotométrique Analyse Step 7

2. Calibrer la machine avec le blanc. Placez le blanc dans le support de cuvette et fermez le couvercle. Sur un spectrophotomètre analogique, il y aura un écran avec une aiguille qui se déplace en fonction de l`intensité de la détection de la lumière. Lorsque le vide est dans, vous devriez voir que l`aiguille passe à droite. Enregistrez cette valeur au cas où vous en auriez besoin pour plus tard. Avec le vide toujours dans la machine, déplacez l`aiguille à zéro à l`aide du bouton de réglage.

Les spectrophotomètres numériques peuvent être calibrés de la même manière, ils auront juste une lecture numérique. Définissez le blanc sur 0 à l`aide des boutons de réglage.

Lorsque vous retirez le blanc, l`étalonnage sera toujours en place. Lorsque vous mesurez le reste de vos échantillons, l`absorbance de l`ébauche sera automatiquement soustraite.

Assurez-vous d`utiliser un seul blanc par session afin que chaque échantillon soit calibré sur le même blanc. Par exemple, si vous nettoyez le spectrophotomètre, n`agissez-en que des échantillons et de la pince à nouveau, les échantillons restants seraient inexacts. Vous auriez besoin de recommencer.

Image intitulée DO Spectrophotométrique Étape 8

3. Retirez le vide et testez l`étalonnage. Avec le blanc enlevé, l`aiguille devrait rester à 0 (zéro) ou la lecture numérique devrait continuer à lire 0. Placez le retour en blanc dans la machine et assurez-vous que l`aiguille ou la lecture ne change pas. Si la machine est correctement calibrée avec votre blanc, tout devrait rester à 0.

Si l`aiguille ou la lecture n`est pas 0, répétez les étapes d`étalonnage avec le blanc.

Si vous continuez à avoir des problèmes, demandez-vous ou demandez à la machine pour la maintenance.

Image intitulée Do Analyse spectrophotométrique Étape 9

4. Mesurer l`absorbance de votre échantillon expérimental. Retirez le vide et placez l`échantillon expérimental dans la machine. Faites glisser la cuvette dans la rainure désignée et assurez-vous qu`il se trouve debout. Attendez environ 10 secondes jusqu`à ce que l`aiguille soit stable ou jusqu`à ce que les numéros numériques arrêtent de changer. Enregistrez les valeurs de% Transmittance et / ou d`absorbance.

L`absorbance est également connue sous le nom de densité optique (OD).

Plus la lumière transmise, moins l`échantillon absorbe l`échantillon. Généralement, vous souhaitez enregistrer les valeurs d`absorbance qui seront généralement données comme décimales, par exemple, 0.43.

Si vous obtenez un résultat périphérique (tel que 0.900 quand les autres sont autour de 0.400), diluer l`échantillon et mesurer l`absorbance à nouveau.

Répétez la lecture pour chaque échantillon individuel au moins 3 fois et les moyen ensemble. Cela garantit une lecture plus précise.

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5. Répétez le test avec des longueurs d`onde successives de la lumière. Votre échantillon peut avoir plusieurs composés inconnus qui varieront dans leur absorbance en fonction de la longueur d`onde. Éliminer les incertitudes, répétez vos lectures à 25 minutes d`intervalle dans le spectre. Cela vous permettra de détecter d`autres produits chimiques soupçonnés d`être dans le soluté.

Partie 3 sur 3:

Analyser les données d`absorbance

1. Calculer la transmittance et l`absorbance de l`échantillon. La transmittance est la quantité de lumière qui passait à travers l`échantillon atteint le spectrophotomètre. L`absorbance est la quantité de lumière absorbée par l`un des produits chimiques du soluté. De nombreux spectrophotomètres modernes ont une sortie de transmittance et d`absorbance, mais si vous enregistrez l`intensité, vous pouvez calculer ces valeurs.

La transmittance (t) se trouve en divisant l`intensité de la lumière qui a traversé la solution d`échantillonnage avec la quantité passée à travers le blanc. Il est normalement exprimé en décimal ou en pourcentage. T = i / i₀ où je suis l`intensité de l`échantillon et je₀ est l`intensité du blanc.
L`absorbance (A) est exprimée en tant que négatif du logarithme de base-10 (exposant) de la valeur de transmittance: A = -Log_dixT. Pour une valeur T de 0.1, la valeur d`A est 1 (0.1 est de 10 à la puissance de -1), ce qui signifie que 10% de la lumière est transmis et 90% sont absorbés. Pour une valeur T de 0.01, la valeur d`A est 2 (0.01 est de 10 à la puissance de -2), ce qui signifie que 1% de la lumière est transmis.

Image intitulée DO Spectrophotométrique Étape 12

2. Tracer les valeurs d`absorbance par rapport aux longueurs d`onde sur un graphique. La valeur d`absorbance est tracée sur l`axe Y vertical contre la longueur d`onde de la lumière utilisée pour un test donné tracé sur l`axe x horizontal. Tracer les valeurs d`absorbance maximales pour chaque longueur d`onde de la lumière testée, produit le spectre d`absorbance de l`échantillon et identifie les composés constituant la substance d`essai et leurs proportions.

Un spectre d`absorbance a généralement des pics à certaines longueurs d`onde qui peuvent vous permettre d`identifier des composés spécifiques.

Image intitulée DO Spectrophotométrique Étape 13

3. Comparez votre parcelle de spectre d`absorbance aux parcelles connues de composés spécifiques. Les composés ont un spectre d`absorbance unique et produiront toujours un pic à la même longueur d`onde chaque fois qu`ils sont mesurés. En comparant vos parcelles de composés inconnus à ceux des composés connus, vous pouvez identifier les solutés qui composent votre solution.

Vous pouvez également utiliser cette méthode pour identifier les contaminants dans votre échantillon. Si vous attendez 1 pic clair à une longueur d`onde spécifique et que vous obtenez 2 pics à des longueurs d`onde séparées, vous savez que quelque chose n`est pas juste dans votre échantillon.